12. Разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови

Этап №1

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №1 в период с 05.08.2014 г. по 31.12.2014 г. выполнялись следующие работы:

• Выполнен аналитический обзор научно-технической, методической литературы по теме ПНИ.
• Проведены патентные исследования по теме.
• Определено направление дальнейших исследований для разработки регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний.
• Определены оптимальные параметры массива нанопроволок, формирующего структуру фотонного кристалла.
• Разработан метод изготовления массива нанопроволок на кремниевой подложке и оптимизированы параметры его изготовления.
• Изготовлены первые экспериментальные образцы подложек биосенсора.
• Разработана подложка экспериментального образца биосенсора. Подложка будет представлять собой пластину кремния с расположенными на ней 6 аналитическими лунками диаметром 7 мм, что соответствует стандартной лунке 96-луночного планшета, соответствующего стандарту ANSI/SLAS 4-2004 "for Microplates – Well Positions".
• Изготовлены высоколюминесцентные квантовые точки CdSe/ZnS,
• Разработана методика переведения квантовых точек в водную фазу.
• Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.

При этом были получены следующие результаты:

• Проанализировано более 130 (статей в ведущих журналах, монографий) источников, из которых более 60 источников за 2009-2014г, по следующим направлениям ПНИ: методы детекции онкомаркеров, применение нанопроволок для создания биосенсоров, оптические свойства и методы создания фотонных кристаллов, методы синтеза квантовых точек.
• Показано, что объект разработки соответствует современному техническому уровню и является патентоспособным.
• На основе полученных данных определено направление дальнейших исследований для разработки регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний. Биосенсор будет изготавливаться на основе подложки, представляющей собой массив нанопроволочных структур, формирующих фотонный кристалл в планарной геометрии с использованием методов электронно-лучевой литографии и реактивного ионного травления. В качестве базовой методики выявления онкомаркеров был выбран метод ИФА. В качестве детекторных оптических меток будут использованы коньюгаты антител с квантовыми точками CdSe/ZnS. Квантовые точки будут изготовлены путем коллоидного синтеза в органической среде с применением инжекционной методики.
• Определены оптимальные параметры массива нанопроволок, формирующего структуру фотонного кристалла: будут изготавливаться нанопроволоки круглого сечения, с диаметром 100-250 нм и высотой около 0.8 мкм, расстояние между нанопроволоками порядка 150-300 нм. Такая геометрия массива позволит селективно усилить оптический сигнал флуоресценции квантовых точек в видимой области.
• На данном этапе разработан метод изготовления массива нанопроволок на кремниевой подложке и оптимизированы параметры его изготовления. Массив нанопроволок будет изготовлен методом реактивного ионного травления с использованием никелевой маски, создаваемой с помощью электронно-лучевой литографии.
• Были изготовлены первые экспериментальные образцы подложек биосенсора, представляющих собой массив нанопроволочных структур, и изучена их морфология. По своим параметрам данные массивы удовлетворяют требованиям, указанным в ТЗ.
• Разработана подложка экспериментального образца биосенсора. Подложка будет представлять собой пластину кремния с расположенными на ней 6 аналитическими лунками диаметром 7 мм, что соответствует стандартной лунке 96-луночного планшета, соответствующего стандарту ANSI/SLAS 4-2004 "for Microplates – Well Positions".
• Методом коллоидного синтеза в органической среде были изготовлены высоколюминесцентные квантовые точки CdSe/ZnS, имеющие квантовый выход фотолюминесценции >90% в органической фазе. Ядра CdSe были изготовлены по инжекционной методике, впоследствии на них в режиме послойного наращивания была нанесена оболочка ZnS.
• Разработана методика переведения квантовых точек в водную фазу. Получен ряд водорастворимых КТ, стабилизированных различными производными полиэтиленгликоля с различными значениями поверхностного заряда. Изучена коллоидная стабильность водорастворимых КТ при различных значениях рН. Полученные образцы водорастворимых КТ обладают квантовым выходом люминесценции 57% и стабильны в водных растворах при физиологических значениях рН, как минимум, в течение 3 месяцев при хранении на +4.

Полученные на первом этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта, и будут использованы на следующих этапах выполнения соглашения.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап №2

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №2 в период с 01.01.2015 г. по 30.06.2015 г. выполнялись следующие работы:

• Разработан метод подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами.
• Разработан способ подачи и забора аналита в зону массива нанопроволочных структур.
• Оптимизированы условия активации массива нанопроволочныхструктур аффинным реагентами, специфичными к целевым белкам.
• Разработаны методики изготовления экспериментальных образцов регенерируемого нанопроводного биосенсора.
• Разработаны методики регенерации биосенсора для повторного использования.
• Разработаны методики получения конъюгатов квантовых точек с детекторными антителами, высокоспецифичными к маркерам рака молочной железы и рака простаты.
• Изготовлены экспериментальные образцы коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
• Разработаны программы и методики испытаний экспериментальных образцов коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
• Произведено материально-техническое обеспечение работ.

При этом были получены следующие результаты:

• Разработан метод подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами: для этого были отработаны условия химической модификации поверхности биосенсора. В результате на поверхность были введены карбоксильные функциональные группы, необходимые в дальнейшем для иммобилизации распознающих антител. Разработана методика подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами.
• Разработан способ подачи и забора аналита в зону массива нанопроволочных структур, который включает пробоподготовку аналита (образцов сыворотки крови человека) и внесение аналита в зону массива нанопроволочных структур в ручном режиме с помощью механического дозатора.
• Проведена оптимизация условий активации массива нанопроволочных структур аффинным реагентами, специфичными к целевым белкам. Проведена научно-исследовательская работа по иммобилизации как модельных, так и целевых антител на поверхность нанопроволочного массива. Подобраны оптимальные условия для эффективной иммобилизации антител без существенной потери их функциональной активности.
• Разработана методика изготовления экспериментальных образцов регенерируемого нанопроволочного биосенсора. Проведена иммобилизация распознающих антител, детекция антигена с использованием конъюгатов квантовых точек с распознающими антителами, и регенерация сенсора. Разработан. Лабораторный регламент изготовления экспериментальных образцов биосенсора для регистрации целевых белков.
• Разработана методика регенерации биосенсора, позволяющая проводить до 5 циклов регенерации.
• Разработана методики получения конъюгатов квантовых точек с детекторными антителами, высокоспецифичными к маркерам рака молочной железы и рака простаты.
• Изготовлены экспериментальные образцы коньюгатов детекторных антител, специфичных к простатическому специфическому антигену, с квантовыми точками. Исследована активность и стабильность полученных конъюгатов.
• Разработана программа и методика испытаний экспериментальных образцов коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками, которая включает ряд физико-химических и иммунологических методов исследования конъюгатов.
• Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.

Полученные на втором этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта, и будут использованы на следующих этапах выполнения соглашения.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап №3

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №3 в период с 01.08.2015 г. по 31.12.2015 г. выполнялись следующие работы:

• Изготовлены экспериментальные образцы биосенсора.
• Разработана методика экспериментальных исследований оптических свойств и морфологии фотонных кристаллов на основе кремниевых нанопроволок (подложки биосенсора), а также оптических характеристик получаемых биосенсоров.
• Разработана программа и методика экспериментальных исследований экспериментальных образцов биосенсоров.
• Проведены дополнительные патентные исследования, подготовлена заявка на получение патента.
• Разработан способ корпусирования биосенсора для адаптации конструкции к применению в стандартных флюоресцентных ридерах для ИФА.
• Проведены испытания экспериментальных образцов коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
• Произведено материально-техническое обеспечение работ.

При этом были получены следующие результаты:

• Изготовленные экспериментальные образцы регенерируемого нанопроволочного био-сенсора, представляют собой массив нанопроволок на поверхности кремниевой пластины, функцио-нализированный распознающими антителами, специфичными к целевым белкам.
• Была разработана методика экспериментальных исследований оптических свойств и морфологии фотонных кристаллов на основе кремниевых нанопроволок (подложки биосенсора), а также оптических характеристик получаемых биосенсоров. Была разработана установка для измерения оптических характеристик фотонных кристаллов. Данные работы позволят провести исследование исследования оптических свойств фотонных кристаллов и биосенсоров на 4-м этапе проекта.
• В результате работ 2-го и 3-го этапов подана заявка на патент на изобретение – способ создания экспериментального образец регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови.
• Разработанный способ корпусирования показал по результатам испытаний полную совместимость со стандартыми флуоресцентными ридерами.
• Экспериментальные образцы конъюгатов детекторных антител с квантовыми точками выдержали испытания: на гистограмме распределения частиц по гидродинамическому диаметру имелся один симметричный пик со средним значением не более 30 нм.
• Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.

Полученные на третьем этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта, и будут использованы на следующих этапах выполнения соглашения.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап №4

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №4 в период с 01.01.2016 г. по 30.06.2016 г. выполнялись следующие работы:

• Проведено исследование оптических свойств и морфологии фотонных кристаллов на основе кремниевых нанопроволок, а также оптических характеристик экспериментальных образцов биосенсоров
• Изучено влияние параметров массивов нанопроволок, формирующих фотонный кристалл, на оптические характеристики биосенсора, чувствительность к целевым белкам, а также регенерируемость биосенсора
• Изучено влияние параметров морфологии нанопроволок, формирующих фотонный кристалл, на оптические характеристики биосенсора, чувствительность к целевым белкам, а также регенерируемость биосенсора
• Изучено влияние способа модификации поверхности нанопроволок на возможность введения функциональных групп для дальнейшей ковалентной иммобилизации антител
• Изучено влияние способа ковалентной иммобилизации антител на поверхность нанопроволок, а также их концентрации на чувствительность к целевым белкам
• Изучено влияние состава регенерирующего раствора (рН, ионная сила, наличие детергентов и др.), а также условий промывки на качество регенерации и повторной работы биосенсора
• Разработана технология изготовления экспериментальных образцов регенерируемого нанопроводного биосенсора
• Проведены дополнительные патентные исследования, подготовлена заявка на получение патента
• Разработан проект инструкции по эксплуатации, согласно ГОСТ 2.610-2006.
• Изготовлены коньюгаты детекторных антител с квантовыми точками
• Осуществлено материально-техническое обеспечение работ
• Подготовлен чертеж общего вида биосенсора

При этом были получены следующие результаты:

• Определены оптимальные параметры массивов нанопроволок и их морфологии: гексагональная структура с размером ячейки 280 нм, диаметром проволоки 100 нм и высотой 600 нм.
• Показано, что расстояние между нанопроволоками во многом играет определяющую роль с точки зрения достижения максимальной чувствительности. Установлено, что оптимальные по своим характеристикам биосенсоры могут быть сконструированы на основе массивов нанопроволок со следующими параметрами: расстояние между нанопроволоками – 280 нм, диаметр единичной нанопроволоки – 100 нм.
• Установлено, что оптимальные по своим характеристикам биосенсоры могут быть сконструированы на основе массивов нанопроволок со следующими параметрами: расстояние между нанопроволоками – 280 нм, диаметр единичной нанопроволоки – 100 нм.
• Было установлено, что окисление поверхности нанопроволок необходимо проводить в растворе серной кислоты и перекиси водорода в соотношении 3/1, разбавленном деионизованной водой в 3 раза, в течение 2 часов.
• Показано, что для прочного связывания и сохранения биосенсорами высокой эффективности детекции целевых белков оптимальным является проведение ковалентного связывания антител с помощью карбодиимидной реакции в течении 30 минут и при 25°С.
• Показано, что наиболее эффективен регенерирующий раствор, представляющий собой 0,1М глицин – HCl буфер, рН 2,8.
• Разработан «Лабораторный регламент изготовления экспериментальных образцов биосенсора для регистрации целевых белков».
• Проведены дополнительные патентные исследования согласно ГОСТ Р 15.011-96, подготовлена заявка на получение патента «Универсальный адаптер для использования микрочипов планарного типа в планшетных ридерах для иммунофлуоресцентного анализа».
• Разработан проект инструкции по эксплуатации, согласно ГОСТ 2.610-2006.
• Индустриальным партнером в соответствие с пунктом 3.10 ТЗ были изготовлены стабильные и функционально активные конъюгаты КТ (с максимумом флуоресценции при длине волны 560 нм) с моноклональными антителами, специфичными к CEA и CA 27.29 в количестве 0,4 мг и 0,3 мг соответственно
• Осуществлено материально-техническое обеспечение работ
• Подготовлен чертеж общего вида биосенсора в соответствии с ГОСТ 2.102-68.

Полученные на четвертом этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта, и будут использованы на заключительном этапе выполнения соглашения.

Этап №5

В ходе выполнения проекта по Соглашению с Минобрнауки России о предоставлении субсидии от «23» сентября 2014 г. № 14.575.21.0065 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» на этапе №5 в период с 01.07.2016 г. по 31.12.2016 г. выполнялись следующие работы:

При этом были получены следующие результаты:

• Экспериментальные образцы биосенсора изготовлены в соответствие с лабораторным регламентом, соответствуют ТЗ (3.24, 4.2.1, 4.2.4) и могут быть испытаны по разработанной Программе и методикам испытаний экспериментальных образцов биосенсора согласно плану-графику, а также могут быть использованы для детекции онкомаркеров: СА 15-3, свободного и связанного PSA, CEA и CA 27.29 в сыворотке крови.
• Разработан и изготовлен экспериментальный образец корпусного адаптера для использования биосенсора со стандартными флуоресцентными ридерами, используемыми в лабораторной клинической практике, обеспечивающий выполнение пункта 4.2.6 ТЗ. Подготовлен чертеж общего вида экспериментального образца корпусного адаптера.
• Разработана программа и методики испытаний экспериментальных образцов биосенсора, которая позволит провести соответствующую проверку соответствия биосенсора требованиям ТЗ.
• Проведены испытания экспериментальных образцов биосенсоров, изготовленных по скорректированному лабораторному регламенту, в соответствии с разработанной программой и методиками испытаний:

• Выполнено дополнительное патентное исследование, согласно ГОСТ Р 15.011-96 (пункт 5.2 ТЗ) и подана заявка на патент (пункт 5.4 ТЗ), частичная версия которой приведена в отдельном документе (см. «Заявка на патент «Регенерируемый нанопроволочный биосенсор для регистрации маркеров заболеваний»»), также приложены информационная карта РИД и уведомление ФИПС о поступлении заявки.
• Проведена оценка полноты решения задачи и достижения поставленных целей ПНИ. Проведен анализ проделанной работы по проекту за все пять этапов. Установлено соответствие полученных результатов целям и задачам ТЗ.
• Разработаны технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики.
• Разработан проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка опытного образца регенерируемого биосенсора для детектирования маркеров заболеваний в сыворотке крови».
• Проведены работы по достижению показателей результативности проекта.
• Осуществлено материально-техническое обеспечение работ.

Полученные на пятом этапе результаты полностью соответствуют поставленным задачам, согласно Плану-графику и Техническому заданию проекта.